BBL омолоджує клітини шкіри генетично. Дослідження Стенфордського університету.

Дослідження Стенфордського Університету¹ довели, що: Після процедур Forever Young BBL “омолоджується” понад 1000 РНК старіючої шкіри, активність генів клітин стає подібною до молодих клітин. Омолоджені гени беруть участь у регулювання таких функцій клітин як:

• Довголіття
• Тривалість життя клітини
• Придушення пухлинних процесів

Це клінічно проявляється у:

• Збільшення еластичності шкіри
• Більше однорідного та впорядкованого розподілу колагену
• Корекції дрібних зморшок, пігментних плям та судинних патологій

Аналіз експресії генів

¹Chang A, Bitter P, et al. (2012) Journal of Investigative Dermatology advance online publication 30 August 2012; doi: 10.1038.jid.2012.187.

Дослідження, що проводяться на моделях організмів, припускають, що клітини, що старіють, можуть бути функціонально омолоджені. Але чи застосовна ця концепція до шкіри людини? Досі це питання залишалося недоведеним. Пропонуємо вам ознайомитися з результатами дослідження, в ході якого вивчалися генні зміни, що відбуваються внаслідок фотостаріння та природного старіння (хроностаріння) шкіри людини, а також впливу процедур широкосмугового світла (BBL) на ці процеси. З'ясувалося, що старіння шкіри асоційовано зі значними змінами в РНК і що процедури BBL дозволяють їх «омолоджувати», тобто робити більш подібними до експресії з генами клітин молодої шкіри. Таким чином, процедура BBL може відновлювати експресію генів у клітинах з фото- та хронологічним старінням шкіри людини, подібно до клітин молодої шкіри.

Вступ

Старіння є складним процесом комплексних генетичних змін та впливу навколишнього середовища та пов'язане з множинними змінами експресії генів. Але яким чином зміни генетично позначаються на здоров'я людини, досі залишається невідомим. Численні мутації одиничних генів показують продовження життя в моделях організмів (Partridge, 2010; de Magalhaes та співавт., 2012). Обмеження дієти також можуть уповільнювати швидкість старіння, навіть якщо починають використовуватися в кінці життя (Partridge, 2010). Зовсім недавно в декількох виступах було показано омолодження клітин або тканин, що старіють, демонструють дивовижну оборотність процесів старіння. Наприклад, при гетерохронному парабіозі молодих та старих мишей вивільняються циркуляторні фактори, які відновлюють функції старіючих стовбурових клітин м'язів (Liu and Rando, 2011). Крім того, блокування фактора транскрипції NF-kB у старих клітинах епідермісу мишей може переривати клітинне старіння і відновлювати загальну експресію генів клітин старої шкіри, роблячи їх подібними до молодих клітин (Adler et al., 2007). Виникає питання: мають питання ж оборотністю процеси старіння в шкірі людини, що розвиваються протягом десятиліть, а не місяців чи років, як було показано на моделях мишей? Виявлення застосовних у житті методів блокування процесів старіння є серйозним викликом. Широкосмугове світло (BBL), відоме також як широкосмугове імпульсне світло, – загальнодоступна та популярна процедура «омолодження» шкіри, є ідеальною технологією для тестування цієї концепції. Згідно з даними Американського товариства естетичної та пластичної хірургії (ASAPS), у 2009 році в США на ці процедури було витрачено понад 215 млн. доларів. На відміну від абляційних процедур, що покращують стан шкіри за рахунок термічної деструкції та регенерації епідермісу та поверхневого шару дерми, BBL використовує широкосмугове некогерентне світло в діапазоні від 560 до 1200 нм, яке поглинається багатьма компонентами шкіри. В даний час процедури BBL використовуються для зменшення виразності зморшок, при порушенні пігментації, при еритемі та еластозі (Bitter Jr, 2000; Negishi et al., 2001). Тим не менш молекулярні зміни, що викликаються цією процедурою, поки що описані не були. Термін «омолодження» використовується як дослідниками, так і широкими верствами населення, і кожен вкладає в нього своє поняття. Саме тому потрібно визначитись із дефініцією. У цьому дослідженні ми трактуємо поняття «омолодження» як відновлення показників молодості в клітинах, що старіють, і тканинах. ДієЧи після процедури BBL шкіра омолоджується на молекулярному рівні і стає подібною до молодої шкіри або ж зміни, що відбуваються, пов'язані з рановими процесами і регенерацією пошкоджень, що фундаментально відрізняється від молодої неушкодженої шкіри? Гістологічні дослідження підтверджують, що BBL достовірно знижує вміст меланіну в дермі і усуває телеангіектазії (Bitter Jr, 2000; Prieto та співавт., 2002). Також у кількох дослідженнях повідомлялося про збільшення вмісту колагену у верхніх шарах сосочкової дерми до третього тижня після процедури (Negishi et al., 2001). Однак синтез нового колагену може мати мінливий або короткостроковий ефект: дані ультраструктурного аналізу шкіри через 3 місяці після процедури не показали ознак впливу на колаген та еластин (Prieto et al., 2002). Ми вивчили молекулярні основи відповіді на процедури BBL, визначаючи загальну експресію генів шкіри людини з фотостарінням та хронологічним старінням після процедур BBL. Метою було відстежити широкий спектр змін в РНК старіючих клітин при впливі BBL, включаючи зміни експресії генів (кодованих та некодованих) та регуляцію генів.

Учасники дослідження та матеріали

Це дослідження проведено відповідно до Гельсінської декларації. Після ознайомлення та підписання поінформованої згоди п'яти жінкам учасницям віком від 50 років провели процедури BBL на лівому передпліччі. Критеріями включення до дослідження були тип шкіри II або III за Фітцпатриком та помірний або виражений ступінь старіння шкіри на передпліччі (McKenzie та співавт., 2010). Відвідування соляріїв, місцеве нанесення ретиноїдів та проведення будь-яких процедур на шкірі рук було заборонено за 1 місяць до початку та протягом усього дослідження. Учасники були проінструктовані захищати свої руки за допомогою сонцезахисних кремів широкого спектру та одягу з довгими рукавами, а також уникати зайвого контакту із сонцем. Процедура проводилася на платформі Joule компанії Sciton з використанням модуля BBL. Учасникам проводили 3 процедури з інтервалом 4 тижні з використанням фільтрів 515 або 560 нм одним імпульсом тривалістю 10-20 мс з питомою потужністю 8-14 Дж/см2. Під час однієї процедури виконували два або більше проходи.
Через 4 тижні після 3-ї процедури BBL проводилася Punch-біопсія ділянок шкіри розміром 4 мм на обробленій шкірі та на сусідній необробленій ділянці. мм) з ділянок шкіри, що не піддаються впливу сонячних променів, у п'яти учасниць віком до 30 років, які мали ті ж критерії включення в дослідження, але не мали ознак фотостаріння на руках.
Зразки були розділені навпіл і поміщені в розчин для стабілізації РНК або розчин формаліну для фарбування гемотоксилін-еозином.

Гістологія шкіри

1. Рука жінки 73 років до процедури BBL (штрих-лінія вказує зону процедури, пов'язка вказує контрольну зону, що не піддається лікуванню)
2. Та сама рука після трьох процедур BBL: відзначається редукція дрібних зморшок, зменшення гіперпігментації та еритеми на обробленій ділянці шкіри (зона, позначена штрих-лінією) порівняно з необробленою ділянкою
3. Таблиця нижче - Показники старіння шкіри: значне зменшення дрібних зморшок, зменшення виразності пігментації та зниження загального показника старіння шкіри після процедури BBL. Значення Р. Відповідно до двостороннього t-тесту
4. Гістологія шкіри до процедури BBL показує наявність еластозу (збільшення х 200, фарбування гемотоксилін-еозином, ГЕ)
5. Редукція еластозу (х 200, ГЕ) після процедури BBL
6. До процедури – явний еластоз (збільшення х 200, фарбування по von Giesen)
7. Після процедур еластоз менш виражений (збільшення х 200, фарбування по von Giesen)
8. До процедури волокна колагену дезорганізовані та неупорядковані (збільшення х 200, фарбування PAS)
9. Після процедур волокна більш однорідні (збільшення х 200, фарбування PAS). Ціна поділу – 1 мм

Клінічні та гістологічні зміни

Після трьох процедур BBL на шкірі рук відбувалися поліпшення клінічних показників хронологічного старіння та старіння шкіри під впливом факторів зовнішнього середовища: дрібні зморшки (Р = 0,03), пігментація (Р = 0,02) та загальні показники старіння шкіри (Р = 0,01) (рис. 1 а-с). За даними гістологічного дослідження, ознаки еластозу у зразках старіючих шкіри з ділянок, що зазнали процедури BBL, були менш виражені, порівняно зі зразками старіючої шкіри, що не піддавалися впливу BBL (рис. 1 d-g). Забарвлення гістологічних зразків методом PAS не показало змін у кількості колагену в дермі між оброблюваними та необроблюваними зразками шкіри, хоча після процедури BBL волокна колагену були менш дезагреговані (рис. 1h-i). Зразки старіючої шкіри після процедури показували суб'єктивне збільшення щільності епідермісу (рис. 1 e, g, i) порівняно з не лікованими зразками старіючої шкіри (рис. 1 d, f, h).

Дослідження генних змін

Щоб точно виявити ознаки старіння в закінченнях молекул РНК, ми спочатку виявляли порушення транскрипції ділянок генів, асоційованих зі старінням шляхом порівняння зразків молодої шкіри зі зразками нелікованої старіючої шкіри, а потім тестували, який вплив робить процедура BBL на зміну цих показників. Порівняння рівнів транскрипції мРНК у молодій необробленій шкірі та старіючій необробленій шкірі, а також у старіючій необробленій та старіючій обробленій, показало значне збільшення рівнів експресії в 3530 генах (рис. 2 а). Спрямованість зміни генів після процедури BBL показана малюнку 2 а: блакитним відзначено дворазове зменшення, а жовтим – двократне збільшення експресії. Для візуального відображення значних генів ми використовували візуальну теплову карту. Праворуч від неї ми розташували таблицю, пурпурові смуги якої відображають основні біологічні ефекти, які відповідають гени, відповідно до генної онтологією. Наприклад, «омолоджені гени» і lncRNAs (довгі, що не кодуються РНК) розташовані в обох верхніх і нижніх частинах візуальної теплової карти. Гени, які відповідають за імунну відповідь та трансляцію, розташовані в нижній половині карти. Гени, які відповідають за клітинну адгезію, розташовані у верхній частині карти. Активність цих генів знижена у групі молодих волонтерів та збільшена у групі не лікованих волонтерів зі старіючої шкірою, а у групі лікованих волонтерів зі старіючої шкірою активність генів адгезії перебуває на середньому рівні. Сусідна таблиця з пурпурними стовпцям вказує на те, в яких генах відбуваються зміни та за які біологічні процеси відповідають ці гени. Візуальна теплова таблиця за допомогою «теплих» (жовтий, підвищення) та «холодних» (синій, зниження) кольорів вказує спрямованість зміни активності генів – збільшення або зниження їх функції, що дозволяє порівнювати молоду шкіру, що старіє, не ліковану та старіючу ліковану шкіру. Наприклад, молода шкіра та лікована стара шкіра показують збільшення рівнів транскрипції, що відповідають за «імунну відповідь» та «трансляцію», оскільки обидві ці групи показали збільшення активності генів (жовтий колір). І навпаки: у групі не лікованих пацієнтів зі старіючої шкірою відбувається зниження активності генів (синій) «імунної відповіді» та «трансляції» порівняно з двома іншими групами. Генні зміни, пов'язані зі старінням, багатогранні та поєднують у собі зміни кількох біологічних функцій.

Перша п'ятірка найбільш виражених змін із підвищенням активності генів старіючої не лікованої шкіри, порівняно з молодою не лікованою шкірою, включає:

• трансляція (Р = 4,7 х 10^-12);
• трансляційне подовження (Р = 5,1 х 10^-7);
• трансляційне подовження (Р = 5,1 х 10^-7);
• макромолекулярні складні комплекси (Р = 7,5 х 10^-6);
• нкРНК (що не кодуються РНК), відповідальні за метаболізм (Р = 6,2 х 10^-6);
• РНК процесинг (Р = 2,5х10^-6).

Перша п'ятірка генів зі зниженням функції групи старіючої не лікованої шкіри, порівняно з молодою шкірою, включала:

• гени, що відповідають за клітинну адгезію (Р = 1,5 х 10^-17);
• біологічна адгезія (Р = 1,5 х 10^-17);
• гомофільна клітинна адгезія (Р = 7,8 х 10^-8);
• ген, який відповідає за розвиток скелета (Р = 3,2 х 10^-7);
• ензим-зв'язаний білок-рецептор сигнального шляху (Р = 5,2 х 10^-6).

Зміни в цих генах нагадують зміни набору генів при старінні в інших тканинах та організмах.

BBL змінює експресію генів

Гени, рівень експресії яких у старіючій шкірі, лікованої BBL, був ближчим до генів молодої не лікованої шкіри, були позначені RGs («омолоджені гени»). Ієрархічна кластеризація показала, що експресія генів лікованої старіючої шкіри більш подібна до не лікованої молодої шкіри, ніж з не лікованої старіючої шкіри (рис. 2 а).

Омолоджені гени відповідають за зчеплені з ними певні біологічні функції, шість найбільш виражених з них:

• трансляція (P = 5,8 х 10^-11);
• РНК-процесинг (Р = 6,3 х 10^-8);
• нкРНК процесингу метаболізму (Р = 1,4 х 10^-7);
• регуляція клітинного метаболізму білка (Р = 1,6 х 10^-5);
• макромолекулярні катаболічні процеси (Р = 2,1 х 10^-5);
• клітинний цикл (Р = 2,4 х 10^-5) (рис. 2b, праворуч вгорі).

Докладніше дослідження показало експресію «омолоджених» процедурою BBL генів, пов'язаних з ключовими регуляторами, відомими, як гени, що контролюють старіння (рис. 2с).

Вони включають:

• ZMPSTE24 – металопротеїназу, яка переробляє ламін А. Дефект цього гена викликає синдром вираженого передчасного старіння, прогерію Хатчинсона-Гілфорда.
• рецептор IGF1R – цей ген безпосередньо пов'язаний зі старінням та довгожительством у моделях людини, мишей та інших організмів (Liang et al., 2011; Tazearslan et al., 2011).
• Інші «омолоджені гени» – EIF4G1 і EIF4EBP1 – відповідають за підвищення тривалості життя у Caenorhabditis elegans (вільноживуча нематода, яка широко використовується як модельний організм) (Curran і Ruv , 2007).
• MLL - регулятор транскрипції, пов'язаний з теломерами (Caslini et al., 2009), і метилат H3K4, який відповідає за нормальну тривалість життя у C.elegans (Greer і співавт., 2010).
• MAP3K5 (ASK10) – регулює активність кіназ у відповідь на оксидативний стрес у моделі старіючих мишей Klotho (Hsieh та співавт., 2010).
• PSMD8 – є компонентом протеасом, порушення роботи яких сприяє старінню шкіри людини (Hwang та співавт., 2007).
• RING1 і MOV10 – беруть участь у процесах, що контролюють тривалість життя фібробластів людини (Itahana та співавт., 2003).
• EEF2 (еукаріотичний фактор трансляції елонгації 2) – був також віднесений до «омолоджених генів». Згідно з дослідженнями, він пов'язаний зі зниженням синтезу білка у щурів (Parado та співавт., 1999).
• Нарешті, ряд генів-супресорів, які контролюють клітинний цикл і забезпечують цілісність геному, таких якING4 супресор пухлини, DAXX і MSH2, були також «омолоджені».

Вплив процедури BBL на імунну відповідь відображається у зміні показників імунної відповіді порівняно зі зразками нелікованої молодої шкіри. Рисунок 2а показує, що хоча гени, які відповідають за імунну відповідь, «підвищують» активність після процедури, цей профіль «підвищення» більше нагадує молоду не ліковану шкіру. Це передбачає, що невелика частина імунної відповіді, яка «підвищилася» після процедури, є частиною «омолодження» і є неспецифічною відповіддю на процедуру BBL. Таким чином, процедура BBL здатна відновлювати безліч молекулярних властивостей молодої шкіри в клітинах шкіри людини, що старіють, щонайменше у короткостроковій перспективі. До того ж, ми не виявили змін експресії генів, пов'язаних із рановими процесами та процесами рубцеутворення.

Специфічна відповідь на омолодження BBL

На додаток до ефектів, пов'язаних з експресією вік-асоційованих генів, ми також розглянули можливість того, що процедура BBL може мати специфічну лікувальну дію, не пов'язану зі старінням. Наприклад, процедура BBL могла б стимулювати процеси загоєння ран або рубцеутворення, на додаток до омолоджуючої дії. Ми виявили суттєві зміни експрєсії 1112 генів, які спостерігалися тільки у зразках, що пройшли процедуру BBL, але цих змін не було виявлено у зразках не лікованої молодої і не лікованої старіючої шкіри. Серед цих генів зі специфічною відповіддю на процедуру п'ять найбільш виражених біологічних ефектів зі збільшенням експресії генів після процедури:

• імунна відповідь (Р = 3,8 х 10^-12);
• позитивне регулювання імунної системи (Р = 2,0 х 10^-8);
• активація клітин (Р = 5,7 х 10^-8);
• активації Т-клітин (Р = 6,0 х 10^-7);
• захисні реакції (Р = 1,4 х 10^-7).

Ці реакції пов'язані з імунною відповіддю на BBL і відрізняються від імунної відповіді генів, які також збільшувалися у не лікованих молодих. П'ятьма найбільш значущими біологічними ефектами, пов'язаними зі зниженням експресії генів після процедури, були:

• регуляція транскрипції (Р = 2,0 х 10^-6);
• транскрипція (Р = 1,7 х 10^-5);
• відповідь на органічні речовини (Р = 1,1 х 10^-4);
• відповідь на гормональні стимули (Р = 4,4 х 10^-4);
• негативне регулювання транскрипції (Р=4,7х10^-4).

Ці гени відрізняються від попередньо описаних ефектів на «загоєння», які характеризують відповідь процеси загоєння шкіри (Chang та співавт., 2005); однак складно зробити пряме порівняння, оскільки немає описаних у літературі еквівалентних нашим даним за активністю генів, пов'язаних рановими процесами на 4-й тиждень. порівняно з не лікованою старіючої шкірою наведено у таблиці 1.

Дискусія

Отримані результати показують, що регулятори старіння організму можуть бути змінені в шкірі людини завдяки використанню загальнодоступної технології BBL. Наскільки пластичні процеси старіння і наскільки вони можуть змінюватися в бік оздоровлення шкіри, ще потрібно з'ясувати. у роботі генів, пов'язаних із процесами старіння. Що видимі клінічні зміни обумовлені функціональним омолодженням шкіри (як мінімум на короткий період часу), а не зовнішньою косметичною імітацією виду молодої шкіри. Оскільки фотоомолоджування BBL існує менше 20 років, довгострокові ефекти BBL-терапії ще потрібно визначити. Хоча в даному дослідженні оцінювали стан шкіри через 4 тижні після процедури, неясно, як довго зберігається цей клінічний ефект та молекулярні зміни. Невідомо також, наскільки стійко зберігається ефект таких пов'язаних з віком станів, як себорейний кератоз або актинічний кератоз з часом. Може бути інформативним досліджувати нинішніх учасників у довгостроковій перспективі з фотографуванням та біопсією шкіри, щоб визначити тривалість клінічного, гістологічного та молекулярного ефекту процедури BBL. не вивчені. Наприклад, відомо, яким чином BBL поглинається різними мішенями – меланіном та гемоглобіном, що призводить до зменшення еритеми та пігментації. Це попереднє дослідження, і ми вивчатимемо вплив BBL на молоду шкіру. У цьому дослідженні ми не проводили процедур BBL на молодій шкірі (у осіб віком до 30 років), оскільки вони не мали клінічних показань; ці особи не мали помітних ознак фотостаріння та хроностаріння шкіри передплічь. Оскільки малоймовірно, що BBL буде використовуватися на практиці на молодій шкірі без ознак фотостаріння (за винятком видалення волосся), ми не включили цю групу в дослідження. Дані про можливий вплив BBL на синтез колагену суперечливі, згідно з доступними джерелами. Хоча деякі доповіді вказують на гістологічні зміни, індуковані процедурою BBL, включаючи неогенез колагену (Negishi та співавт., 2001), в інших дослідженнях цих змін не зазначається (Prieto та співавт., 2002). Згідно з даними останнього дослідження, не зазначено також змін у вмісті еластину після процедури. У нашому дослідженні не було зазначено суттєвих змін у вмісті колагену після процедури на пофарбованих за PAS зразками. Вони мали зниження кількості еластину на препаратах, забарвлених за von Giesen. Ми не виявили суттєвих змін рівнів експресії генів колагену та еластину після процедури. Можливо, причина полягає в одному паркані матеріалів для тестів, що могло не захопити проміжок часу, коли рівень експресії генів колаген та еластин зазнавав суттєвих змін. Подальші дослідження з біопсією шкіри дозволять виявити кінетику процесів активації/супресії генів-мішеней. Крім того, метою цьогого дослідження було вийти за рамки простого гістологічного аналізу шкіри та вивчити молекулярні зміни при старінні шкіри та вплив на них процедур BBL. Ми досліджували безліч змін у генах сполучної тканини, які можуть модулюватися BBL.

Наступні дослідження з великими вибірками можуть дозволити нам виявити додаткові значущі гени (як кодовані, так і не кодовані), експресія яких змінюється в порівнянні старіючої не лікованої шкіри з молодою не лікованої шкірою, а також не лікованої старіючої шкірою з лікованої старіючої шкірою. Великі вибірки можуть дозволити співвіднести ступінь клінічної відповіді зі змінами у «омолоджених» генах.