BBL омолаживает клетки кожи на генном уровне. Исследование Стэнфордского университета.

Исследования Стэндфордского Университета¹ доказали, что:
После процедур Forever Young BBL “омолаживается” более 1000 РНК стареющей кожи, активность генов клеток становится подобной молодым клеткам.

Омоложенные гены участвуют в регуляции таких функций клеток как:

• Долголетие
• Длительность жизни клетки
• Угнетение опухолевых процессов

Это клинически проявляется в:

• Увеличении эластичности кожи
• Более однородному и упорядоченному распределению коллагена
• Коррекции мелких морщин, пигментных пятен и сосудистых патологий

Анализ экспрессии генов

Возможно ли омоложение клеток кожи человека?

Исследования, проводимые на моделях организмов, предполагают, что стареющие клетки могут быть функционально омоложены. Но применима ли эта концепция к коже человека? До сих пор этот вопрос оставался недоказанным. Предлагаем вам ознакомиться с результатами исследования, в ходе которого изучались генные изменения, происходящие вследствие фотостарения и естественного старения (хроностарения) кожи человека, а также влияние процедур широкополосного света (BBL) на эти процессы.

Выяснилось, что старение кожи ассоциировано со значительными изменениями в РНК и что процедуры BBL позволяют их «омолаживать», то есть делать более сходными по экспрессии с генами клеток молодой кожи. Таким образом, процедура омоложения BBL может восстанавливать экспрессию генов в клетках с фото- и хронологическим старением кожи человека, активируя их, подобно клеткам молодой кожи.

Введение

Старение является сложным процессом комплексных генетических изменений и воздействия окружающей среды и связано с множественными изменениями экспрессии генов. Но каким образом изменения на генном уровне сказываются на здоровье человека, до сих пор остается неизвестным. Многочисленные мутации единичных генов показывают продление жизни в моделях организмов (Partridge, 2010; de Magalhaes и соавт., 2012). Ограничения в диете также могут замедлять скорость старения, даже если начинают использоваться в конце жизни (Partridge, 2010). Совсем недавно в нескольких выступлениях было показано омоложение стареющих клеток или тканей, демонстрирующих удивительную обратимость процессов старения. Например, при гетерохронном парабиозе молодых и старых мышей высвобождаются циркуляторные факторы, которые восстанавливают функции стареющих стволовых клеток мышц (Liu and Rando, 2011). Кроме того, блокирование фактора транскрипции NF-kB в старых клетках эпидермиса мышей может прерывать клеточное старение и восстанавливать общую экспрессию генов клеток старой кожи, делая их подобными молодым клеткам (Adler et al., 2007).

Возникает вопрос: обладают ли такой же обратимостью процессы старения в коже человека, которые развиваются в течение десятилетий, а не месяцев или лет, как было показано на моделях мышей? Выявление применимых в жизни методов блокирования процессов старения является серьезным вызовом.

Широкополосный свет (BBL), известный также как широкополосный импульсный свет, – общедоступная и популярная процедура «омоложения» кожи, является идеальной технологией для тестирования этой концепции. Согласно данным Американского общества эстетической и пластической хирургии (ASAPS), в 2009 году в США на эти процедуры было потрачено более 215 млн долларов. В отличие от абляционных процедур, улучшающих состояние кожи за счет термической деструкции и регенерации эпидермиса и поверхностного слоя дермы, BBL использует широкополосный некогерентный свет в диапазоне от 560 до 1 200 нм, который поглощается многими компонентами кожи. В настоящее время процедуры BBL используются для уменьшения выраженности морщин, при нарушении пигментации, при эритеме и эластозе (Bitter Jr, 2000; Negishi et al., 2001).

Тем не менее молекулярные изменения, вызываемые этой процедурой, пока описаны не были.

Термин «омоложение» используется как исследователями, так и широкими слоями населения, и каждый вкладывает в него свое понятие. Именно поэтому требуется определиться с дефиницией. В данном исследовании мы трактуем понятие «омоложение» как восстановление показателей молодости в стареющих клетках и тканях. Действительно ли после процедуры BBL кожа омолаживается на молекулярном уровне и становится подобной молодой коже или же происходящие изменения связаны с раневыми процессами и регенерацией повреждений, что фундаментально отличается от молодой неповрежденной кожи?
Гистологические исследования подтверждают, что BBL достоверно снижает содержание меланина в дерме и устраняет телеангиэктазии (Bitter Jr, 2000; Prieto и соавт., 2002). Также в нескольких исследованиях сообщалось об увеличении содержания коллагена в верхних слоях сосочковой дермы к третьей неделе после процедуры (Negishi et al., 2001). Однако синтез нового коллагена может носить изменчивый или краткосрочный эффект: данные ультраструктурного анализа кожи через 3 месяца после процедуры не показали признаков влияния на коллаген и эластин (Prieto et al., 2002).

Мы изучили молекулярные основы ответа на процедуры BBL, определяя общую экспрессию генов кожи человека с фотостарением и хронологическим старением после процедур BBL. Целью являлось отследить широкий спектр изменений в РНК стареющих клеток при воздействии BBL, включая изменения экспрессии генов (кодируемых и некодируемых) и регуляцию генов.

Участники исследования и материалы

Данное исследование проведено в соответствии с Хельсинской декларацией. После ознакомления и подписания информированного согласия пяти женщинам участницам в возрасте старше 50 лет провели процедуры BBL на левом предплечье. Критериями включения в исследование были тип кожи II или III по Фитцпатрику и умеренная или выраженная степень старения кожи на предплечье (McKenzie и соавт., 2010). Посещение соляриев, местное нанесение ретиноидов и проведение любых процедур на коже рук было запрещено за 1 месяц до начала и в течение всего исследования. Участники были проинструктированы защищать свои руки с помощью солнцезащитных кремов широкого спектра и одежды с длинными рукавами, а также избегать лишнего контакта с солнцем.

Процедура проводилась на платформе Joule компании Sciton с использованием модуля BBL. Участникам проводили 3 процедуры с интервалом 4 недели с использованием фильтров 515 или 560 нм одним импульсом длительностью 10–20 мс с удельной мощностью 8–14 Дж/см2. Во время одной процедуры выполнялись два или более прохода.

Через 4 недели после 3-й процедуры BBL проводилась Punch-биопсия участков кожи размером 4 мм на обработанной коже и на соседнем необработанном участке.

Также проводилась Punch-биопсия (4 мм) с участков кожи, не подвергающихся воздействию солнечных лучей, у пяти участниц в возрасте до 30 лет, которые имели те же критерии включения в исследование, но не имели признаков фотостарения на руках.

Образцы были разделены пополам и помещены в раствор для стабилизации РНК или раствор формалина для окрашивания гемотоксилин-эозином.

Гистология кожи до и после омоложения BBL

1. Рука женщины 73 лет до процедуры BBL (штрих-линия указывает зону процедуры, повязка указывает контрольную зону, не подвергающуюся лечению)
2. Та же рука после трех процедур BBL: отмечается редукция мелких морщин, уменьшение гиперпигментации и эритемы на обработанном участке кожи (зона, обозначенная штрих-линией) в сравнении с необработанным участком
3. Таблица ниже - Показатели старения кожи: значительное уменьшение выраженности мелких морщин, уменьшение выраженности пигментации и снижение общего показателя старения кожи после процедуры BBL. Значение Р. Согласно двухстороннему t-тесту
4. Гистология кожи до процедуры BBL показывает наличие эластоза (увеличение х 200, окрашивание гематоксилин-эозином, ГЭ)
5. Редукция эластоза (х 200, ГЭ) после процедуры BBL
6. До процедуры – явный эластоз (увеличение х 200, окрашивание по von Giesen)
7. После процедур эластоз менее выражен (увеличение х 200, окрашивание по von Giesen)
8. До процедуры волокна коллагена дезорганизованы и неупорядочены (увеличение х 200, окрашивание PAS)
9. После процедур волокна более однородны (увеличение х 200, окрашивание PAS). Цена деления – 1 мм

Клинические и гистологические изменения после процедур BBL

После трех процедур омоложения BBL на коже рук происходили улучшения клинических показателей хронологического старения и старения кожи под воздействием факторов внешней среды: мелкие морщинки (Р = 0,03), пигментация (Р = 0,02) и общие показатели старения кожи (Р = 0,01) (рис. 1 а-с). По данным гистологического исследования, признаки эластоза в образцах стареющих кожи с участков, подвергшихся процедуре BBL, были менее выражены, в сравнении с образцами стареющей кожи, не подвергавшихся воздействию BBL (рис. 1 d-g).

Окрашивание гистологических образцов методом PAS не показало изменений в количестве коллагена в дерме между обрабатываемыми и необрабатываемыми образцами кожи, хотя после процедуры BBL волокна коллагена были менее дезагрегированы (рис. 1 h-i). Образцы стареющей кожи после процедуры показывали субъективное увеличение плотности эпидермиса (рис. 1 e, g, i) в сравнении с не леченными образцами стареющей кожи (рис. 1 d, f, h).

Исследование генных изменений

Чтобы точно выявить признаки старения в окончаниях молекул РНК, мы вначале выявляли нарушения транскрипции участков генов, ассоциированных со старением путем сравнения образцов молодой кожи с образцами не леченной стареющей кожи, а затем тестировали, какое влияние оказывает процедура BBL на изменение этих показателей. Сравнение уровней транскрипции мРНК в молодой необработанной коже и стареющей необработанной коже, а также в стареющей необработанной и стареющей обработанной, показало значительное увеличение уровней экспрессии в 3 530 генах (рис. 2 а). Направленность изменения генов после процедуры BBL показана на рисунке 2 а: голубым отмечено двукратное уменьшение, а желтым – двукратное увеличение экспрессии. Для наглядного визуального отображения значимых генов мы использовали визуальную тепловую карту. Справа от нее мы расположили таблицу, пурпурные полосы которой отображают основные биологические эффекты, за которые отвечают гены, в соответствии с генной онтологией. Например, «омоложенные гены» и lncRNAs (длинные не кодируемые РНК) расположены в обеих верхних и нижних частях визуальной тепловой карты. Гены, отвечающие за иммунный ответ и трансляцию, расположены в нижней половине карты. Гены, отвечающие за клеточную адгезию, расположены в верхней части карты. Активность этих генов снижена в группе молодых волонтеров и увеличена в группе не леченных волонтеров со стареющей кожей, а в группе леченных волонтеров со стареющей кожей активность генов адгезии находится на среднем уровне. Соседняя таблица с пурпурными столбцам указывает на то, в каких генах происходят изменения и за какие биологические процессы отвечают эти гены. Визуальна тепловая таблица при помощи «теплых» (желтый, повышение) и «холодных» (синий, снижение) цветов указывает направленность изменения активности генов – увеличение или снижение их функции, что позволяет сравнивать молодую кожу, стареющую не леченную и стареющую леченную кожу. Например, молодая кожа и леченная старая кожа показывают увеличение уровней транскрипции, отвечающих за «иммунный ответ» и «трансляцию», поскольку обе эти группы показали увеличение активности генов (желтый цвет). И наоборот: в группе не леченных пациентов со стареющей кожей происходит снижение активности генов (синий) «иммунного ответа» и «трансляции» в сравнении с двумя другими группами. Генные изменения, связанные со старением, многогранны и объединяют в себе изменения нескольких биологических функций.

Гены, активирующиеся при старении кожи

Первая пятерка наиболее выраженных изменений с повышением активности генов стареющей не леченной кожи, в сравнении с молодой не леченной кожей, включает:

• трансляция (Р = 4,7 х 10^-12);
• трансляционное удлинение (Р = 5,1 х 10^-7);
• трансляционное удлинение (Р = 5,1 х 10^-7);
• макромолекулярные сложные комплексы (Р = 7,5 х 10^-6);
• нкРНК (не кодируемые РНК), отвечающие за метаболизм (Р = 6,2 х 10^-6);
• РНК процессинг (Р = 2,5х10^-6).

Гены со снижением активности при старении

Первая пятерка генов со снижением функции в группе стареющей не леченной кожи, в сравнении с молодой кожей, включала:

• гены, отвечающие за клеточную адгезию (Р = 1,5 х 10^-17);
• биологическая адгезия (Р = 1,5 х 10^-17);
• гомофильная клеточная адгезия (Р = 7,8 х 10^-8);
• ген, отвечающий за развитие скелета (Р = 3,2 х 10^-7);
• энзим-связанный белок-рецептор сигнального пути (Р = 5,2 х 10^-6).

Изменения в этих генах напоминают изменения набора генов при старении в других тканях и организмах.

Изменение активности генов после процедур BBL

Гены, уровень экспрессии которых в стареющей коже, после омоложения BBL, был ближе к генам молодой не леченной кожи, были обозначены RGs («омоложенные гены»). Иерархическая кластеризация показала, что экспрессия генов леченной стареющей кожи более сходна с не леченной молодой кожей, чем с не леченной стареющей кожей (рис. 2 а).

"Омоложенные" гены отвечают за сцепленные с ними определенные биологические функции, шесть наиболее выраженных из них:

• трансляция (P = 5,8 х 10^-11);
• РНК-процессинг (Р = 6,3 х 10^-8);
• нкРНК процессинга метаболизма (Р = 1,4 х 10^-7);
• регуляция клеточного метаболизма белка (Р = 1,6 х 10^-5);
• макромолекулярные катаболические процессы (Р = 2,1 х 10^-5);
• клеточный цикл (Р = 2,4 х 10^-5) (рис. 2b, справа вверху).

Более детальное исследование показало экспрессию «омоложенных» процедурой BBL генов, связанных с ключевыми регуляторами, известными, как гены, контролирующие старение (рис. 2с).

Они включают:

• ZMPSTE24 – металлопротеиназу, которая перерабатывает ламин А. Дефект этого гена вызывает синдром выраженного преждевременного старения, прогерию Хатчинсона-Гилфорда.
• рецептор IGF1R – этот ген непосредственно связан со старением и долгожительством в моделях человека, мышей и других организмов (Liang et al., 2011; Tazearslan et al., 2011).
• Другие «омоложенные гены» – EIF4G1 и EIF4EBP1 – отвечают за повышение продолжительности жизни у Caenorhabditis elegans (свободноживущая нематода, которая широко используется как модельный организм) (Curran и Ruvkun, 2007).
• MLL – регулятор транскрипции, связанный с теломерами (Caslini et al., 2009), и метилат H3K4, который отвечает за нормальную продолжительность жизни у C.elegans (Greer и соавт., 2010).
• MAP3K5 (ASK10) – регулирует активность киназ в ответ на оксидативный стресс в модели стареющих мышей Klotho (Hsieh и соавт., 2010).
• PSMD8 – является компонентом протеасом, нарушение работы которых способствует старению кожи человека (Hwang и соавт., 2007).
• RING1 и MOV10 – участвуют в процессах, контролирующих длительность жизни фибробластов человека (Itahana и соавт., 2003).
• EEF2 (эукариотический фактор трансляции элонгации 2) – был также отнесен к «омоложенным генам». Согласно исследованиям, он связан со снижением синтеза белка у крыс (Parado и соавт., 1999).
• Наконец, ряд генов-супрессоров, которые контролируют клеточный цикл и обеспечивают целостность генома, таких как ING4 супрессор опухоли, DAXX и MSH2, были также «омоложены».

Влияние процедуры BBL на иммунный ответ отражается в изменении показателей иммунного ответа, по сравнению с образцами не леченной молодой кожи. Рисунок 2 а показывает, что хотя гены, отвечающие за иммунный ответ, «повышают» активность после процедуры, этот профиль «повышения» больше напоминает молодую не леченную кожу. Это предполагает, что небольшая часть иммунного ответа, которая «повысилась» после процедуры, является частью «омоложения» и является неспецифическим ответом на процедуру BBL.
Таким образом, процедура BBL способна восстанавливать множество молекулярных свойств молодой кожи в стареющих клетках кожи человека, по меньшей мере, в краткосрочной перспективе. К тому же, мы не обнаружили изменений экспрессии генов, связанных с раневыми процессами и процессами рубцеобразования.

Специфический ответ генов на омоложение BBL

Активация иммунного ответа кожи

В дополнение к эффектам, связанным с экспрессией возраст-ассоциированных генов, мы также рассмотрели возможность того, что процедура BBL может оказывать специфическое лечебное действие, не связанное со старением. Например, что процедура BBL могла бы стимулировать процессы заживления ран или рубцеобразования, в дополнение к омолаживающему действию. Мы выявили существенные изменения экспрессии 1112 генов, которые наблюдались только в образцах, прошедших процедуру BBL, но этих изменений не было выявлено в образцах не леченной молодой и не леченной стареющей кожи. Среди этих генов со специфическим ответом на процедуру пять наиболее выраженных биологических эффектов с увеличением экспрессии генов после процедуры были:

• иммунный ответ (Р = 3,8 х 10^-12);
• положительная регуляция иммунной системы (Р = 2,0 х 10^-8);
• активация клеток (Р = 5,7 х 10^-8);
• активации Т-клеток (Р = 6,0 х 10^-7);
• защитные реакции (Р = 1,4 х 10^-7).

Эти реакции связаны с иммунным ответом на BBL и отличаются от иммунного ответа генов, которые также увеличивались у не леченых молодых. Пятью наиболее значимыми биологическими эффектами, связанными со снижением экспрессии генов после процедуры, были:

• регуляция транскрипции (Р = 2,0 х 10^-6);
• транскрипция (Р = 1,7 х 10^-5);
• ответ на органические вещества (Р = 1,1 х 10^-4);
• ответ на гормональные стимулы (Р = 4,4 х 10^-4);
• отрицательная регуляция транскрипции (Р=4,7х10^-4).

Эти гены отличаются от предварительно описанных эффектов, обусловливающих «заживление», которые характеризуют ответ процессы заживления кожи (Chang и соавт., 2005); однако сложно сделать прямое сравнение, поскольку нет описанных в литературе эквивалентных нашим данным по активности генов, связанных раневыми процессами на 4-ю неделю.

И наконец, топ-10 генов, повышающих активность и снижающих активность у леченных BBL со стареющей кожей в сравнении с не леченной стареющей кожей приведены в таблице 1.

Дискуссия

Полученные нами результаты показывают, что регуляторы старения организма могут быть изменены в коже человека благодаря использованию общедоступной технологии BBL. Насколько пластичны процессы старения и насколько они могут изменяться в сторону оздоровления кожи, еще предстоит выяснить.

Хотя фотоомоложение BBL используется больше для придания коже внешне «молодого» вида, наше исследование показало, что наблюдается омоложение кожи на молекулярном уровне, с многочисленными изменениями в работе генов, связанных с процессами старения. Что видимые клинические изменения обусловлены функциональным омоложением кожи (как минимум на короткий период времени), а не внешней косметической имитацией вида молодой кожи.

Поскольку фотоомоложение BBL существует менее 20 лет, долгосрочные эффекты BBL-терапии еще предстоит определить. Хотя в данном исследовании оценивали состояние кожи через 4 недели после процедуры, неясно, как долго сохраняется этот клинический эффект и молекулярные изменения. Неизвестно также, насколько стойко сохраняется эффект у таких связанных с возрастом состояний, как себорейный кератоз или актинический кератоз со временем. Может быть информативным исследовать нынешних участников в долгосрочной перспективе с фотографированием и биопсией кожи, чтобы определить длительность клинического, гистологического и молекулярного эффекта процедуры BBL.
Точные механизмы, при помощи которых BBL (некогерентное световое излучение) изменяет экспрессию генов, на данный момент хорошо не изучены. Например, известно, каким образом BBL поглощается различными мишенями – меланином и гемоглобином, что приводит к уменьшению эритемы и пигментации.

Это предварительное исследование, и мы будем изучать влияние BBL на молодую кожу. В данном исследовании мы не проводили процедур BBL на молодой коже (у лиц в возрасте моложе 30 лет), поскольку они не имели клинических показаний; эти лица не имели различимых признаков фотостарения и хроностарения кожи предплечий. Поскольку маловероятно, что BBL будет использоваться на практике на молодой коже без признаков фотостарения (за исключением удаления волос), мы не включили эту группу в исследование.

Данные о возможном влиянии BBL на синтез коллагена противоречивы, согласно доступным источникам. Хотя некоторые доклады указывают на гистологические изменения, индуцированные процедурой BBL, включая неогенез коллагена (Negishi и соавт., 2001), в других исследованиях этих изменений не отмечается (Prieto и соавт., 2002). Согласно данным последнего исследования, не отмечено также изменений в содержании эластина после процедуры. В нашем исследовании не было отмечено существенных изменений в содержании коллагена после процедуры на окрашенных по PAS образцах. Они имели снижение количества эластина на препаратах, окрашенных по von Giesen. Мы не обнаружили существенных изменений уровней экспрессии генов коллагена и эластина после процедуры. Возможно, причина заключается в одном заборе материалов для тестов, что могло не захватить промежуток времени, когда уровень экспрессии генов коллаген и эластин претерпевал существенные изменения. Последующие исследования с биопсией кожи позволят выявить кинетику процессов активации/супрессии генов-мишеней. Кроме того, целью данного исследования было выйти за рамки простого гистологического анализа кожи и изучить молекулярные изменения при старении кожи и влияние на них процедур BBL. Мы исследовали множество изменений в генах соединительной ткани, которые могут модулироваться BBL.

Последующие исследования с большими выборками могут позволить нам выявить дополнительные значимые гены (как кодируемые, так и не кодируемые), экспрессия которых изменяется в сравнении стареющей не леченной кожи с молодой не леченной кожей, а также не леченной стареющей кожей с леченной стареющей кожей. Большие выборки могут позволить соотнести степень клинического ответа с изменениями в «омоложенных» генах.

Клинические исследования BBL

Использованная литература

1. Anne Lynn S. Chang, Patrick H. Bitter Jr., Kun Qu, Meihong Lin, Nicole A. Rapicavoli, Howard Y.
   Rejuvenation of Gene Expression Pattern of Aged Human Skin by Broadband Light Treatment: A Pilot Study.
   Journal of Investigative Dermatology (2013) 133, 394–402; DOI:https://doi.org/10.1038/jid.2012.287